自2006年问世以来，诱导多功能干细胞（iPSc）的发展可谓一路高歌，相关论文层出不穷，然而，就在其高歌猛进之际，却传来了不和谐的声音。最近，不断有科学家撰文指出其发展过程中可能会遇到几只“拦路虎”，诱导多功能干细胞开始遭遇“成长烦恼”．

iPS细胞的研发突飞猛进

在科学发展史上，5年不过一瞬间，但是，希望通过重组成人细胞以彻底革新再生医学的美好愿景从概念的提出到现在几乎成为现实也不过5年。2006年8月，日本东京大学的科学家山中伸弥首次利用病毒载体将四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和Myc）的组合转入老鼠分化的体细胞中，使其重新编程而得到了类似胚胎干细胞的一种细胞类型——诱导多功能干细胞，其可以变成任何类型的细胞。第二年，山中伸弥使用人类皮肤重复了该实验并取得了成功。

诱导多功能干细胞拥有明显的优势：它们可使用成人的细胞制成，不需要人类的胚胎，避免利用人类胚胎制造多功能干细胞饱受的争议；诱导多功能干细胞可用从罹患某种疾病的患者身上提取的组织或细胞制成，这样，科学家们就可以根据该病人的基因，“量体裁衣”地为其设计治疗方案。

科学家们认为，这种通过将完全分化的体细胞重编程，不经胚胎阶段而直接逆转至多功能干细胞状态的诱导多功能干细胞，在再生医学领域拥有重要的应用潜力，在药物筛选方面也将“大展拳脚”。

甚至有些科学家表示，诱导多功能干细胞或许已经开始“发威”了。在过去一年里，科学家们已经使用诱导多功能干细胞制造出了很多人体细胞的模型，有望应用于心脏疾病、精神分裂症等慢性病的治疗。而且，基于诱导多功能干细胞的疗法正朝临床迈进。例如，在美国加州，一个科研团队希望于三年之内获得政府的批准，可以使用大疱性表皮松解症病患的诱导多功能干细胞制造的皮肤组织来治疗这些病患。

问题慢慢浮现

然而，过去几个月内，不断有科学家发表论文指出，其最新研究成果表明，诱导多功能干细胞的发展遇到了几只“拦路虎”。首先，细胞重组的效率可能很低，或许还会诱发基因变异；其次，经过重组的细胞也无法发育成任何类型的细胞；此外，诱导多功能干细胞制造出的细胞并非都可以用于治疗疾病等等。

实验中，新问题也逐渐浮现出来。科学家近日发表的研究结果表明：当将使用某些老鼠的细胞制成的诱导多功能干细胞移植入其他基因组成相同的老鼠体内时，产生了免疫反应，这就提出了一个问题——是否能将诱导多功能干细胞制造出的身体组织注入为其制造提供原材料的人体内？

没有人怀疑诱导多功能干细胞拥有的巨大潜力，但是，该领域的很多专家最初怀抱的乐观现在已开始慢慢降温。美国加州大学旧金山分校的神经科学家阿诺德·克雷格斯坦表示：“现在，人类还没有掌握足够的知识来利用诱导多功能干细胞的潜能，相关研究也才刚刚开始。”

英国《自然》杂志网站近日就开列了诱导多功能干细胞发展面临的几个问题以及可能的解决办法。

找到好的“配方”

从一开始，生物学家就试图设计出比山中伸弥的方法更安全、更有效的方法来制造诱导多功能干细胞。山中伸弥使用一个逆转录酶病毒将四个基因重组因子递入细胞中。逆转录酶病毒会整合进入一个宿主细胞的DNA（脱氧核糖核酸）中，因此，其会潜在地中断基因表达并诱发癌症；而且，编程因子Myc本身就是一个会引发癌症的致癌基因。

尽管新的、“经过改进的”重组方法似乎层出不穷，但迄今为止，山中伸弥的逆转录酶病毒方法仍然是最有效以及使用最广的。其能将0.01%的人体皮肤细胞经过重组转化为诱导多功能干细胞。相反，并不会被整合入基因组中的腺病毒只能将0.0001%到0.0018%的皮肤细胞转化为诱导多功能干细胞。转化效率低下增加了使用各种细胞制造诱导多功能干细胞的成本和难度，尤其是当某些细胞来源比较少时，难度和成本更高。

研究人员也曾经尝试过让Myc消失，或者一旦重组完成就使其沉默或将其从细胞中剔除，但这些措施同时也降低了重组效率，而且，被沉默的Myc也可能被重新激活。

这些已经成为该领域的科学家现在着手解决的主要问题。科学家们绞尽脑汁地在对他们的重组方案进行修修补补，试图找到最有效而且也不会增加癌症风险的因子和递送手段。

今年4月，美国宾夕法尼亚大学医学院医学、细胞和发育生物学教授兼再生医学研究所科学主管爱德华·莫里西领导的科研团队报告称，他们首次绕开四个转录因子生成了诱导多功能干细胞，并将重编程效率提高了100倍。在采用微RNA（microRNA）替代四个关键的转录因子之前，研究人员每重组10万个成体细胞只能获得不到20个的极少数诱导多功能干细胞。在最新研究中，科学家们利用微RNA新技术诱导10万个人类成体细胞，生成了大约1万个诱导多能干细胞。

美国加州斯克利普斯研究所的发育神经生物学家詹纳·娄伦表示：“对我们来说，让这些新的重组方法很好地工作，以使我们能查看其在细胞的稳定性和致癌风险方面是否与之前的方法有所不同非常重要，还没有人做过类似的尝试，还需要很长时间不断将这些研究推进。”

修补伤口

过去一年，科学家们提出了很多新问题，主要是担心重组过程的遗传影响。2010年7月，美国波士顿儿童医院的生物学家乔治·戴利和麻省总医院的康拉德·霍舍得林格领导的科研团队报告称，他们的研究表明，诱导多功能干细胞具有“表观遗传记忆”，也就是说，重组没有将在原初成人细胞的DNA内进行的化学修改消除，这会让诱导多功能干细胞无法回复到胚胎细胞状态，这样就有可能会对诱导多功能干细胞的发育和分化造成限制，使其不能像胚胎干细胞一样分化为某种组织。

科学家们还报告称，与培育出的人类胚胎干细胞相比，诱导多功能干细胞包含变异的可能性更大。四个科研小组清除了诱导多功能干细胞基因组在单个DNA碱基上的变化、DNA重组（拷贝数变异）和染色体数的差异。这些研究显示，在诱导多功能干细胞上，所有这三者的浓度都更高。更坏的情况是，诱导多功能干细胞内部的变异并不仅仅遗传自母细胞，有些似乎是由重组和培养过程本身所产生。

斯克利普斯研究所的娄伦发现，胚胎干细胞基因组里含有一些DNA重复片段，这些片段和细胞里具有自我更新功能的基因相连；诱导多功能干细胞的基因组里插入了额外的致癌基因和少数的抑癌基因。这些基因组方面的差异可能是由于诱导多功能干细胞的制备和培养操作造成的。

类似的结论接踵而至。其中一项针对重组变异的研究发现，诱导多功能干细胞经过一段时间的培养后，许多重组会消失，很可能因为变异最严重的细胞取代了本身更健康的细胞。

但是，今年1月，美国加州索尔克研究学院的科学家约瑟夫·埃克领导的科研团队报告称，即使这些人类诱导多功能干细胞已被培育了多次并分化为特定的细胞类型后，他们仍然在其中探测到了母细胞的遗传表征信号。还有一个研究表明，诱导多功能干细胞在这方面并不比胚胎干细胞更差。哈佛大学的发育生物学家亚历山大·迈斯纳领导的研究团队在对20个人类胚胎干细胞系和12个诱导多功能干细胞系比较后发现，其遗传表征和遗传变异一样。迈斯纳称：“我们发现，并非只有诱导多功能干细胞存在大量遗传变异，而是所有的多功能细胞都存在大量的变异。”

今年3月21日至22日，美国国家卫生研究院（NIH）和美国食品药品监督管理局（FDA）在马里兰联合主办了一次会议，集中探讨了将多功能干细胞研究带入临床实验面临的种种障碍，在会议上，与会的科学家纷纷表达了对多功能干细胞具有的这些潜在影响的担忧，他们担心变异对细胞可能有意想不到的令人不悦的影响，甚至最终在用此方法进行治疗时，会给病人带来致命的伤害。娄伦表示：“基因组的变异将是FDA需要着力考虑的问题。”

迈斯纳团队设计了一个基因表达和甲基化的“记分卡”，甲基化是表观遗传学的标记物，甲基化与诱导多功能干细胞系的多功能性密切相关，这将有助于科学家们鉴别和避免实验操作导致严重的遗传畸变，并筛选出影响最小的细胞系。科学家们正在着手检测这些遗传和表征效应是否以及如何影响诱导多功能干细胞的能力和特性。

娄伦表示：“现在，科学家们分化为两个阵营。其中一方非常悲观，认为诱导多功能干细胞会带来灭顶之灾，而另外一方则认为现在的研究具有积极的意义，将推动我们发现生物学相关的变异。”

直面极限

诱导多功能干细胞非常灵活，但它们也并非“全能选手”。从理论上来讲，诱导多功能干细胞制造出的肝脏细胞在药物与毒物筛检中可以取代动物。然而，目前科学家们仍在殚精竭虑地尝试让任何人体干细胞分化成功能性的组织，比如一般由内胚层（胚胎中最内的一层）产生的肝脏组织等。这或许因为，科学家们尚不明确这些细胞的发育和复杂功能所必需的信号序列。

加州大学旧金山分校的肝脏专家霍尔格·威伦布林格指出，肝细胞有很多作用，从给血液解毒到制造循环蛋白都少不了它的“身影”。细胞承担了很多不同的任务，但在细胞培养的环境下，很难让其很好地完成这些任务。”

目前，人类干细胞研究最热门的领域之一是利用细胞置换治疗Ⅰ型糖尿病——当胰腺中制造胰岛素的细胞遭到破坏时，人会患上此病。但是，还没有人制造出具有完全功能的、能够分泌胰岛素的成熟胰腺B细胞（其也由内胚层产生），这是因为科学家们目前还不清楚所需要的一系列生长信号。并且，或许也因为胰腺B细胞通常在三维环境中发育而成，而这种三维环境很难在培养皿中再现。

加州大学旧金山分校的发育生物学家马提亚斯·赫布洛克表示，或许这并不是最重要的，科学家们已经使用胚胎干细胞和诱导多功能干细胞制造出了能分泌胰岛素的胰腺B细胞前体。它们的工作效率虽然低于正常的胰腺B细胞，但这种效率或许足以帮助糖尿病患者。

现在，科学家们正在齐心协力设计出正确的配方来制造成熟的B细胞和肝细胞。威伦布林格和其他科学家表示，这是业界人士作为一个团队来一起奋斗。在《自然》杂志近期发表的一篇文章中，中国科学家利用一些对肝脏发育起作用的调控因子，成功地诱导老鼠的皮肤细胞直接生成为类似于肝细胞的细胞，从而规避了诱导多功能干细胞的危险。不过，威伦布林格表示，这些细胞是否能执行肝细胞的所有功能还是个问题。

维持标准

重组相对容易进行，这让任何人都可以涉足诱导多功能干细胞领域的研究，但这一技术诞生伊始科学家们就在担心，较低的进入门槛和相对非常激烈的竞争意味着可能无法获得严苛的标准。克里斯坦表示：“迫于发表论文的压力，很多科学家都没有很好地确定他们所研发出的细胞的特性。”

去年12月，加州大学圣地亚哥分校的神经生物学家阿里松·穆沃提领导的科研团队表示，他们通过从单基因突变造成的雷特氏综合征患者身上提取的细胞获得了诱导多功能干细胞，并证实当这些诱导多功能干细胞分化为神经元时，它们刚开始会表达一些通常只在神经前体细胞中发现的基因，随后会表达与神经信号传递有关的基因。

从这些罹患雷特氏综合征的病人那儿获取的神经元比从没有该疾病的人那儿获取的神经元小，并且，它们也有信号传递缺陷和其他差异。但是，威伦布林格表示，这些分子特征并不足以准确表明形成了何种神经元、它们表达了中央神经系统中的哪部分以及它们与大脑中的异常过程如何相关。威伦布林格说：“报道出的异常或许同可能预期的疾病密切相关。但是，假定大部分神经发育和神经变性疾病都会在发育过程中的某些特定时间段影响特定的神经元群，这一点仍然让我惊诧不已。”

穆沃提则表示，其团队对神经元的分析非常彻底而且深入；电生理测试也表明，这些细胞能启动动作电位并发挥功能。他也指出，大脑中几乎所有的神经元都能表达该基因，因此，他并不希望将研究局限在与雷特氏综合征相关的领域，因为从培养的神经元处获取的结果能解释破坏控制行为的电路的分子机制。穆沃提说：“当我们在培养物中发现这一细胞表型时，我们知道，我们能从那儿开始理解另一层面的复杂性。”

建模很困难

目前，科学家们正在制造患者特异性的诱导多功能干细胞来为各种已知疾病构建模型。但很多时候，科学家们对于他们能从这些模型中获得多少有用信息还有疑问。最大的争议集中在复杂的神经精神疾病和行为学疾病上：经过重组的细胞能真实地模拟精神分裂症或自闭症等疾病吗？哪些因素会以复杂的方式影响大脑和行为？荷兰莱顿大学医学中心的发育生物学家克里斯蒂娜·马默里表示：“我们曾经咨询过临床医师，如果我们能获得来自于智力发育迟缓的患者的诱导多功能干细胞，那么，你将如何测量培养皿中的神经元的智商呢？”

从事这些建模研究的科学家们坚持认为他们的工作非常有意义。今年4月份，索尔克研究所的生物学家弗瑞德·盖吉领导的团队报告称，他们利用精神分裂症病患提供的皮肤细胞生成了神经元，而且证实，抗精神病药物洛沙平可以修复这些神经元与正常神经元之间的很多差异。像穆沃提一样，盖吉表示，这种模型可用于解释导致精神分裂症的遗传因子如何影响神经元的功能。“尽管我们无法测量这些病人的行为，但我们能测量这些神经元的活性。我们的目标是寻找造成这些行为表型的分子过程和细胞过程。”

在诱导多功能干细胞的另一个热点研究领域——与衰老相关的疾病的研究也出现了问题：很多疾病会影响成熟的细胞，因此，可能与诱导多功能干细胞的关联并不大。马默里说：“在帕金森氏症的研究中，就存在这样的问题，你能获得足够成熟的神经元吗？对于科学家而言，生成目的细胞已经很不容易，促使这些细胞成熟更是难上加难。”

但很多研究人员反驳称，即使“年轻的”细胞也显示出了与衰老疾病相关的迹象。斯坦福大学人类胚胎干细胞研究与教育中心主任雷妮·雷霍·派拉教授使用罹患帕金森氏症（其制造多巴胺的神经元受到了破坏）的珍妮娅·布林（谷歌共同创办人谢尔盖·米克哈伊洛维奇·布林的母亲）捐出的细胞，制造出了诱导多功能干细胞。科学家们也证实，与从健康人那儿获得的神经元相比，诱导多功能干细胞一旦分化为神经元，就会分泌出多巴胺，而且，其对能诱导细胞死亡的化学物质更为敏感。雷霍·派拉表示：“这似乎是最好的帕金森氏症模型。”

很多科学家也将该领域正在慢慢浮现的“成长的烦恼”看作是研究已达到某种成熟阶段的标志，他们表示，这些问题不同于很多生物医学研究领域进入临床应用时所面临的问题。梅斯内尔表示：“刚开始，人们充满狂喜，认为诱导多功能干细胞很容易制造，并且无所不能，可以治疗所有疾病。但是，所有这些最新研究向我们发出了警告：事情并非我们想象的那么简单。”

(科技日报)

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